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技術(shù)文章

百螢問號之活性氧 MiteROS 線粒體ROS580實驗方案是怎樣的

百螢 活性氧 MiteROS 線粒體ROS 580概述

MitoROS 線粒體活性氧熒光探針580是用于檢測線粒體活性氧的熒光探針,活性氧(ROS)是含氧的化學(xué)反應(yīng)性分子。實例包括超氧化物,羥基,單線態(tài)氧和過氧化物。由于存在不成對的價電子,ROS具有高反應(yīng)性。ROS形成氧的正常代謝的天然副產(chǎn)物,并且在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用。然而,在環(huán)境壓力(例如,UV或熱暴露)期間,ROS水平可顯著增加。這可能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯著損害。累積地,這被稱為氧化應(yīng)激。MitoROS 580是一種超氧化物敏感染料,在加載到活細(xì)胞后定位于線粒體。超氧化物氧化MitoROS 580會產(chǎn)生紅色熒光。MitoROS 580可用熒光顯微鏡或熒光流式細(xì)胞儀監(jiān)測線粒體中的超氧化物。MitoROS 580試劑滲透活細(xì)胞,選擇性地靶向線粒體。它被超氧化物迅速氧化。它不太可能被其他活性氧(ROS)和活性氮物質(zhì)(RNS)氧化。氧化產(chǎn)物在細(xì)胞中高度熒光。MitoROS 580為研究各種病理中的氧化應(yīng)激提供了有價值的工具。

 

百螢 活性氧 MiteROS 線粒體ROS 580實驗方案體ROS 580實驗方案

 

使用MitoROS580分析方案

該協(xié)議僅提供指南,應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。在制作MitoROS 580工作溶液之前,根據(jù)需要處理細(xì)胞。

 

溶液配制

1MitoROS 580 原液 (1000X)配制

13 μL DMSO 添加到 MitoROS 580 小瓶中并充分混合。注意:未使用的原液可以儲存在 -20 oC,避光保存。

2MitoROS 580 工作溶液(2X)配制

20 mM Hepes 緩沖液 (HHBS) DMSO 原液稀釋到 Hanks 溶液中,制成 2X 工作溶液。注意:2X MitoROS 580 工作液不穩(wěn)定,請及時使用。

 

操作步驟

1.細(xì)胞培養(yǎng)

2.將細(xì)胞(例如 96 孔板中的 100 μL/孔)與等體積的 2X MitoROS 580 工作溶液在 37°C 下孵育 10-30 分鐘,避光。注意:MitoROS 580 的終細(xì)胞濃度不應(yīng)超過 1 X。濃度超過 1 X 會產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng),包括線粒體形態(tài)改變和熒光重新分布到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。注意:不同細(xì)胞對 MitoROS 580 的反應(yīng)不同,請相應(yīng)調(diào)整工作濃度。

3.輕輕清洗細(xì)胞 3 次,并用 HHBS 緩沖液替換。

4.使用適當(dāng)?shù)臒晒鈨x器 (例如, 熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀) 觀察細(xì)胞。(Ex/Em = 510/580 nm

1.MitoRO 580(10μM)對不同活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的熒光響應(yīng)。在Ex/Em = 540/590 nm處監(jiān)測熒光強度

2.使用 MitoROS 580 檢測 Jurkat 細(xì)胞內(nèi)的超氧化物。對于 AMA 處理(紅色),將細(xì)胞在 37°C 下用 50 μM 抗霉素 A (AMA) 處理 30 分鐘,然后與 MitoROS 580 一起孵育 1 小時。對于對照(藍(lán)色),將細(xì)胞在 37°C 下與 MitoROS 580 一起孵育 1 小時,無需事先進(jìn)行 AMA 處理。使用 BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀的 FL2 通道監(jiān)測熒光信號。

 

3.使用 MitoROS 580 HeLa 細(xì)胞中的超氧化物進(jìn)行熒光成像測量。HeLa 細(xì)胞以每孔 100,000 個細(xì)胞的密度接種在 100 μL 中,并在具有黑色壁和透明底部的 96 孔板中孵育過夜。對于 AMA 處理組,在 37°C 下用 50 μM 抗霉素 A (AMA) 處理細(xì)胞 30 分鐘,然后用 MitoROS 580 孵育 1 小時。在未處理的對照組中,在 37°C 下用 MitoROS 580 孵育細(xì)胞 1 小時,無需任何先前的 AMA 處理。使用帶有 TRITC 濾光片的熒光顯微鏡測量熒光信號。

4.使用 MitoROS 580 檢測 HeLa 細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)超氧化物。HeLa 細(xì)胞以每孔 100,000 個細(xì)胞的密度接種在 100 μL 培養(yǎng)基中,并在具有黑色壁和透明底部的 96 孔板中孵育過夜。第 二天,用 50 μM 綠膿菌素 (Pyo)50 μM 抗霉素 A (AMA) 處理細(xì)胞,或不處理作為對照。這些處理在 37°C 下進(jìn)行 30 分鐘。隨后,將細(xì)胞在 37°C 下與 MitoROS 580 一起孵育 1 小時。使用 CLARIOstar 微孔板讀數(shù)儀 (BMG Labtech) 測量熒光信號,激發(fā)/發(fā)射波長為 540/590 nm,截止波長為 570 nm,使用底部讀取模式。

 

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