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技術(shù)文章

百螢課堂 Annexin V-iFluor 700標(biāo)記的實驗過程

01

「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記簡介」

   膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。 它們富含真核生物,屬于參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的普遍存在的細(xì)胞質(zhì)蛋白家族。 膜聯(lián)蛋白V的優(yōu)先結(jié)合配偶體是磷脂酰絲氨酸(PS),其通常保持在細(xì)胞膜的內(nèi)葉(細(xì)胞質(zhì)側(cè))。在細(xì)胞凋亡中,PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面上的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的初始/中間階段的通用指示,并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測到。我們的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物是一組監(jiān)測細(xì)胞功能的工具,旨在通過測量磷脂酰絲氨酸的易位來監(jiān)測細(xì)胞凋亡。

   膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細(xì)胞表面上的PS結(jié)合,它也可以通過壞死細(xì)胞膜或死細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)部的PS結(jié)合。因此,我們建議將細(xì)胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用,以區(qū)分死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

02

「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記適用儀器」

流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡


03

「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記實驗方案」

概述

用測試化合物(200μL/樣品)制備細(xì)胞

添加Annexin V結(jié)合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞:

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液:10mM HEPES,140mM NaCl和2.5mM CaCl2,pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細(xì)胞一段所需的時間(用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.3離心細(xì)胞,得到1-5×105個細(xì)胞/管。

1.4將細(xì)胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液中(來自步驟1.1)。

1.5在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選:在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠,用于壞死細(xì)胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘,避光。

1.7在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前,加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)以增加體積(參見下面的步驟1.8)。

1.8使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強(qiáng)度(參見下面的步驟2或3)。

2.使用流式細(xì)胞儀分析:

通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細(xì)胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意:粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測,因為在細(xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。

3.使用熒光顯微鏡分析:

3.1移取步驟1.6的細(xì)胞懸液,用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)沖洗1-2次,然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)重懸細(xì)胞。將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意:對于粘附細(xì)胞,建議直接在蓋玻片上生長細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育(步驟1.6)后,用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)沖洗1-2次,并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后,細(xì)胞也可以在2%甲醛中固定,并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞


04

「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記數(shù)據(jù)分析」

    下圖是使用流式細(xì)胞儀檢測膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸在Jurkat細(xì)胞凋亡中的結(jié)合活性的實例。在活的非凋亡細(xì)胞中,膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450檢測非誘導(dǎo)細(xì)胞中的先天性細(xì)胞凋亡,其通常為所有細(xì)胞的2-6%。在凋亡細(xì)胞中,膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸結(jié)合,磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜的外部小葉上,導(dǎo)致染色強(qiáng)度增加。

1.在Jurkat細(xì)胞中檢測膜聯(lián)蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰絲氨酸的結(jié)合活性。將Jurkat細(xì)胞在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中不用(藍(lán)色)或用1μM星形孢菌素(紅色)處理5小時,然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分鐘。使用FACSCalibur(Becton Dickinson,San Jose,CA)流式細(xì)胞儀,使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450的熒光強(qiáng)度。

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