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技術(shù)文章

APC與抗體的綴合實(shí)驗(yàn)方案

1:整個(gè)綴合過程可以在 當(dāng)天內(nèi)完成。但是,綴合前對(duì)APC 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面列出的材料外,您還需要濃度至少為 2 mg/ml 的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行APC抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

 

2 : SMCC-APC  綴合物非常穩(wěn)定(交換緩沖液中,在4C下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此,  如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間,可以選擇同時(shí)綴合10 毫克或更多的 APC,并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(在幾周內(nèi))。SMCC-APC 的長(zhǎng)期儲(chǔ)存好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

 

 APC的制備

1.APC 純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml 。 注意:APC 在綴合前作為SAS (硫酸銨鈉)

沉淀物穩(wěn)定。如果將APCSAS 沉淀物的形式儲(chǔ)存,則必須在使用前進(jìn)行大量純化。在用每毫升1 升的透析緩沖液透析之前,用每毫升1 APC PBS進(jìn)行透析2 次。

 

2.使用1 .7毫克APC 修飾每毫克lgG,包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

 

3.檢查 APC 的純度和濃度,請(qǐng)測(cè)量280、620655 nm  處的吸光度。 (1 mg/mlAPC 655nm處的OD 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4表明雜質(zhì)被充分去除;655/280 比 率 > 4 表明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除

 

 .A PC的活化

1.使用前在無水 DMSO 中制備10 mg/mlSMCC儲(chǔ)備溶液。

 

2.每毫克 APC 加 入 6μlSMCC,并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好,室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。

 

3.將純化的 APC 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

 

注意:對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合,增加或減少SMCC相對(duì)于APC 的量,可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

 

. 1gG還原

1.在蒸餾水中制備1MDTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。

 

2.1gG 溶液濃度應(yīng)為4 mg/ml 或更高,這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行; MES 、磷酸鹽和TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于2  mg/ml,則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。

 

3.DTT 配制20 mMlgG 溶液:每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘,無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

 

4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的交換緩沖液過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分,測(cè)定蛋白濃度,并將含有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起??梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

 

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意:對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況,降低 DTT濃度可能會(huì)有所幫助。

 

.進(jìn)行綴合

1.每毫克IgG添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意:這些摩爾比 ( 1gG 2 個(gè) APC)效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合,不同的摩爾比可能會(huì)有所幫助。

 

2.60分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。

 

3.1.0 mlDMSO 中制備10 mg NEM的新鮮溶液。

 

4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 

2.60分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。

 

3.1.0 mlDMSO 中制備 10 mg NEM的新鮮溶液。

 

4.每毫克 |gG添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 

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