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公司新聞

PE與抗體的綴合實(shí)驗(yàn)方案

1:整個(gè)綴合過(guò)程可以在當(dāng)天內(nèi)完成。但是,綴合前對(duì) PE 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面列 出的材料外,您還需要濃度至少為 2 mg/ml   的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行PE 抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

 2 : SMCC-PE  綴合物非常穩(wěn)定 (交換緩沖液中,在4C 下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此, 如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間,可以選擇同時(shí)綴合10 毫克或更多的 PE,  并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(在幾周內(nèi)) SMCC-PE    的長(zhǎng)期儲(chǔ)存好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

 

  .P E   

1. PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml  。 注意: PE  在綴合前作為 SAS  (     ) 沉淀物穩(wěn)定。如果將 PE  SAS  沉淀物的形式儲(chǔ)存,則必須在使用前進(jìn)行大量純化。


2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過(guò)程中損失的額外10%


3. 檢查 PE的純度和濃度,請(qǐng)測(cè)量280565  6 2 0 nm 處的吸光度。  (1mg/ml   PE   565nm   處的 OD   8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白;565/280  > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。

 

 .P E   

1.使用前在無(wú)水 DMSO   中制備 10  mg/ml  SMCC  儲(chǔ)備溶液。

2.每毫克 PE   1 1 μlSMCC, 并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好,室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。

3.將純化的 PE  過(guò)凝膠過(guò)濾柱來(lái)交換緩沖液。

注意:對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合,增加或減少 SMCC   相對(duì)于 PE   的量,可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

 

 . 1gG  

1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4mg/100 μl) 的新鮮溶液。

2.1gG  溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml 或更高,這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行; MES 、磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml,   則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。

3. DTT  配制 20 mMlgG 溶液:每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘,無(wú)需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

4.將還原的lgG 通過(guò)預(yù)平衡的交換緩沖液過(guò)濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分,測(cè)定蛋白濃度,并將含有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起。可以通過(guò)分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意:對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況,降低 DTT 濃度可能會(huì)有所幫助。

 

 .進(jìn)   

1.每毫克 IgG   3.2 毫克 SMCC-PE。用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意:這些摩  IgG  2 個(gè) PE)   效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合,不同的摩爾比可能會(huì)有所幫助。

2.60 分鐘后,必須去掉 lgG   上未反應(yīng)的游離巰基。

3.1.0 ml  DMSO 中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.  |gG  添加 34μ g(3.4μl) 。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 

2.60 分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。

3. 1.0 ml  DMSO  中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

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